В будущем не трудно будет решить, что это – туберкулез или нет… Демонстрация туберкулезной бациллы… решит вопрос
Роберт Кох
Лабораторная диагностика обеспечивает выполнение главной задачи диагностики и лечения туберкулеза – выявление у больного МБТ. В лабораторную диагностику на современном этапе входят следующие методики:
- сбор и обработка мокроты;
- микроскопическая идентификация МБТ в выделяемых субстанциях или тканях;
- культивирование;
- определение резистентности к препаратам;
- серологические исследования;
- выполнение новых молекулярно-биологических методов, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и определение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ).
Сбор мокроты, содержащую МБТ, проводится в специально подготовленном помещении больницы или в амбулаторных условиях. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого. Имеются два удобных для этого типа контейнеров. Один – распространяемый международной организацией UNICEF (ДЕТСКИЙ ФОНД ООН), является пластмассовой пробиркой с черным основанием, прозрачной крышкой, утилизация которого может быть обеспечена сжиганием. На контейнере (не на крышке) отмечаются данные обследуемого. Другой тип контейнера – сделан из прочного стекла, с завинчивающейся крышкой. Такой контейнер может многократно использоваться после дезинфекции, кипячением (10 мин.) и c полной очисткой.
При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении.
Дополнительные процедуры для сбора МБТ.
Забор образцов из гортани тампоном.
У пациентов, не имеющих мокроту, для получения материала для посева МБТ можно использовать тампоны на палочке. Оператор должен носить маску и закрытый халат: язык пациента вытягивается изо рта, одновременно тампон вводится, за языковое пространство ближе к гортани. Во время кашля пациента можно собрать часть слизи. Тампон помещается в закрытый сосуд и направляется в бактериологическую лабораторию.
Промывные воды бронхов.
Для своевременной диагностики туберкулеза легких и и трахеобронхиальной системы большое значение имеет раннее распознавание поражения бронхов. Для этой цели в практике применяется исследование промывных вод бронхов. Методика получения промывных вод не сложна, но надо помнить о противопоказаниях ее применения. Людям старческого возраста промывание бронхов следует делать, с большой осторожностью. Процедура противопоказана при заболеваниях бронхиальной астмой, а также при явлениях сердечно-легочной недостаточности. Для получения промывных вод бронхов больному анестезируют дыхательные пути. Гортанным шприцем вводят 15—20 мл физиологического раствора, подогретого до 37°. Это усиливает секрецию слизистой бронхов. Откашливая, больной выделяет промывные воды. Их собирают в стерильную посуду и обрабатывают обычным способом для бактериоскопии и посева на средах для выращивания БК. Производится исследование отдельного бронха или целого ветвления. Метод бактериоскопии промывных вод, и особенно их посев, увеличил число находок БК на 11—20%.
Промывные воды желудка.
Промывные воды желудка нередко исследуются у детей, которые не умеют откашлять мокроту, а также у взрослых при скудном количестве мокроты. Метод не труден и дает довольно большой процент обнаружения БК в промывных водах желудка или бронхов у больных не только легочным туберкулезом, но и туберкулезом других органов (кожи, костей и суставов и др.).
Для получения промывных вод больной, утром натощак должен выпить стакан кипяченой воды. Затем желудочным зондом собирают воды желудка в стерильную посуду. После этого воды центрифугируют, мазок де¬лают из гнойных элементов полученного осадка, обрабатывают и красят обычным способом, как мокроту.
Исследование спинномозговой жидкости.
При подозрении на туберкулезный менингит необходимо в первые дни сделать анализ спинномозговой жидкости. При взятии спинномозговой жидкости обращается внимание на степень давления, под которым она вытекает из спиномозгового канала. Жидкость, вытекающая непрерывной струей под большим давлением, свидетельствует о повышенном внутричерепном давлении. Жидкость, выделяющаяся крупными частыми каплями, говорит о нормальном давлении, а редкими малыми каплями- о пониженном давлении или о препятствии для истечения ее. Материал для исследования берут в две стерильные пробирки. Одну оставляют на холоде и через 12—24 часа, в ней образуется нежная паутинообразная пленка. Из другой пробирки берут ликвор для биохимических исследований и изучения цитограммы.
Бронхоскопия.
Когда другие методы не сумели обеспечить постановку диагноза, применятся сбор материала непосредственно из бронхов, через бронхоскоп. Биопсия выстилающих бронхи тканей может иногда содержать типичные для туберкулеза изменения, с последующим гистологическим исследованием.
Плевральная жидкость.
В плевральной жидкости МБТ могут быть выявлены с помощью флотации, но обычно обнаруживаются только в культуре. Чем большее количество жидкости используется для культурального исследования, тем вероятней положительный результат.
Биопсия плевры.
Биопсия плевры может быть полезна, в тех случаях, когда имеется ее поражение. При этом необходима специальная биопсийная игла, средства для проведения гистологического исследования и обученный персонал.
Биопсия легкого.
Биопсия легкого должна выполняться хирургом, в стационарных условиях. Диагноз может быть сделан на основе гистологического исследования или обнаружения МБТ в секционном материале.
Микроскопия мокроты.
Уже более 100 лет существует самый простой и быстрый метод выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) – это микроскопия мазка. КУБ – микобактерии способные оставаться окрашенными даже после обработки кислотными растворами и могут быть выявлены с помощью микроскопа в окрашенных образцах мокроты. Микобактерии отличаются от других микроорганизмов характерным составом своей клеточной стенки, состоящей из миколовых кислот, которые, благодаря своим сорбционным свойствам, обеспечивают способность окрашиваться по методикам, выявляющим КУБ. Резистентность к стандартным методам окрашивания и способность МБТ сохранять раннее окрашивание, является следствием высокого содержания липидов во внешней оболочке клетки. Вообще, грамм-положительные бактерии, в своем составе, имеют приблизительно 5 % липидов или воска, грамм-отрицательные организмы около – 20 % и МБТ примерно 60 %. Бактериоскопия мокроты или другого отделяемого проводится «простым» методом и методом флотации. При простом методе мазки приготавливают из комочков мокроты или капель жидкого вещества (экссудата, промывных вод и др.). Материал помещают между двумя предметными стеклами. Один из мазков окрашивают по Грамму на общую флору, другой — на туберкулезные микобактерии.
Метод, который до сих пор используются это карбол-фуксиновый (метод Циля-Нильсена). Основной принцип этого метода состоит в способности наружной оболочки МБТ адсорбировать карбол-фукцин. Поглощая красный карбол-фуксин, наружная мембрана МТБ настолько прочно абсорбирует краску, что ее нельзя удалить обработкой серной кислотой или соляно кислым спиртом. Затем образец обрабатывается метиленовым синим. При эмерсионной микроскопии МБТ появляются в виде красных палочек на синем фоне.
Начиная с 1989 в современных лабораториях флюоресцентная микроскопия в значительной степени вытеснила старые методы, основанные на кислотоустойчивости микобактерий. Этот метод основан на тех же свойствах МБТ, связанные со способностью наружной мембраны МБТ, богатой липидами, удерживать соответствующий краситель в этом случае – аурамин-родамин. МБТ поглощая это вещество, одновременно устойчива обесцвечиванию соляно-кислым спиртом. При этом, МБТ, окрашенные аурамин-родамином, флюоресцируют под воздействием ультрафиолета или другими световыми спектрами света, выделенными соответствующими фльтрами. При этом МБТ проявляются как ярко-желтые палочки на черном фоне.
Подготовка образца для культурального исследования.
При поступлении в современную лабораторию диагностического материала, с возможным содержанием МБТ, проводятся следующие диагностические манипуляции:
- Обработка материала миколитическими разжижающими веществами, с целью удаления белковых масс.
- Деконтаминация образца, с целью удаления сопутствующей бактериальной флоры.
- Встряхивание смеси и ее отстаивание.
- Холодное центрфугирование.
- Содержимое центрифужной пробирки используется для микроскопии, посева на:
- плотную яичную среду (Левенштейна-Йенсена или Финна III);
- агаровые среды (7Н10 и 7Н11);
- на атоматизированную систему бульонного культивирования (MB/BacT или BACTEC MGIT 960)
Молекулярно-генетические методы диагностики МБТ.
Расшифровка генома МБТ открыла неограниченные перспективы, в разработке генетико-молекулярных тестов, в том числе в изучении и выявлении МБТ и ее диагностике в организме человека. Классические методы, применяемые для обнаружения наличия в организме микобактерий туберкулеза, такие как бактериоскопия, культуральный, иммуноферментный, цитологический весьма эффективны, но отличаются или недостаточной чувствительностью, или длительностью выявления МВТ. Развитие и совершенствование молекулярно-диагностических методов открыло новые перспективы для быстрого выявления микобактерий в клинических образцах.
Наибольшее распространение получили метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Метод полимеразной цепной реакции основан на амплификации особых фрагментов бацилярной ДНК, которая обнаруживается в диагностических образцах. Тест предназначен для выявления МБТ в мокроте или для идентификации разновидности бактерий, которые произрастают в культуральной среде. Реакция ПЦР позволяет проводить идентификацию МВТ в диагностическом материале за 5-6 часов (включая обработку материала) и обладает высокой специфичностью и чувствительностью (в диапазоне от 1-10 клеток в образце).